毕业答辩讲稿
P1:大家好，我是倪林峰，孙焱孙老师的学生，我的研究课题是：基于生物信息学与分子生物实验相融合的策略来探索肺腺癌中致癌基因AL022344.4的作用机制，左下角的二维码是一个云端链接，你们可以用任意本地设备扫码获取到本ppt的完整内容，方便各位老师回溯和提问。考虑到演讲的流畅性，我后续会把目的基因简称为44.4。整体研究框架和背景是我们通过生物信息学方法找到一个比较新颖的lncRNA，并利用明辨楼实验室现有的设备试图探索这个lncRNA在肺腺癌疾病中的作用和具体机制。
~（45s）
P2:我本次演讲内容主要分成两大块，一个是我们课题组为什么选择44.4这个基因做研究，二是随着研究深入，我们逐步发现到基因在肺腺癌中所起的作用及初步的机制探索。
~（15s）
P3: 课题组利用生物信息学方法，bioinformatice，就是你们看到左侧的这个句末标注的BI，分析了同时在TCGA和GEO选定肺腺癌数据集中差异表达的lncRNA。26个lncRNA被发现同时在三个数据集的癌组织样本中高表达，其中包括了基因LINC01518。GEPIA2数据库资料显示，LINC01518基因在正常人体组织中仅在睾丸中表达，其它组织不表达或者极少表达。LINC01518在33个经典TCGA癌症种类中的泛癌表达分析也显示除睾丸癌以外，其在大部分肿瘤组织中表达升高。这一部分的工作提示LINC01518基因具有成为肺腺癌“致癌基因”的潜力。
~（45s）
P4: LINC01518被注释为位于10号染色体的长基因间非编码RNA基因。多个同种型转录本均经过注释并符合Ensemble中的转录本支持级别标签。其中包括长度为519个核苷酸的AL022344.4。44.4转录本是一个选定的、有代表性的子集，约占基因编码转录组的一半，生信分析结果显示它在TCGA肺腺癌样本中较GTEx中正常肺组织样本表达显著升高。 QP结果显示44.4在不同肺腺癌细胞系中的表达丰度较正常人支气管上皮细胞（HBEC）升高。五组肺腺癌和匹配癌旁组织临床样本测定结果也显示44.4基因在肿瘤组织中表现出不同程度的升高。RNA核质分离法进行亚细胞定位检测显示44.4在肺腺癌细胞系H157中主要位于细胞质。我在句末标记📌的MBE是分子生物实验molecular biology experiments缩写，实验结果与前期的生信分析结果吻合，你们会在后面看到很多结果都是糅合与贯穿了BI分析和MBE验证的。
~（75s）
P5:为了进一步探究44.4在肺腺癌中的作用，我们采购慢病毒构建44.4过表达和敲低的细胞模型，并通过右侧的镜下荧光图和QP结果验证。
~（15s）
P6:利用构建好的细胞模型，我们开展表型实验探索44.4潜在作用，右侧的这个图是检测细胞增殖作用的CCK-8和克隆形成实验结果，都是阴性的。我们据此认为44.4不影响肺腺癌细胞的增殖效应。
~（15s）
P7:这是表型实验探索44.4对细胞迁移和侵袭影响的划痕实验和transwell结果，我们看到44.4明显改变了肺腺癌细胞的迁移和侵袭特性。
~（15s）
P8:肿瘤细胞发生迁移侵袭改变的内在机制可能是多方面的，包括但不限于肿瘤细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）改变，肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT）转变等。我们对一系列已报道的关键蛋白，比如说ECM相关MMP家族蛋白，EMT相关蛋白做WB初步筛选之后发现，44.4显著改变了细胞EMT进程，证据就是你们现在看到的这几个上皮和间质细胞标志物蛋白质水平随44.4改变发生了趋势统一的改变。
在EMT过程中，上皮细胞会失去其原有的极性和细胞间粘附能力，同时获得间充质细胞的迁移和侵入能力，从而促进肿瘤细胞远处转移和肿瘤的发展。
~（45s）
P9:在意识到44.4确实影响了肺腺癌细胞的生物学功能后，我们尝试探索了其潜在的上游转录因子，你们现在看到的是我们通过基因浏览器和高置信度转录因子库获取的一个名称为ZNF460的转录因子，我们认为它在肺腺癌细胞中起到了调控44.4的作用，来自TCGA的相关性分析支持我们的预测，我们采购ZNF460蛋白质的抗体和对应引物进行WB和QP实验后，基因和蛋白质表达水平呈现很强的同向表达一致性，符合转录因子与配体的正向促进机制，基于此，我们推测，ZNF460是lncRNA-AL022344.4的潜在转录因子。
~（45s）
P10:除了寻找潜在的上游转录因子，我们对44.4的蛋白质翻译潜力进行了初步生信分析，在44.4长度为519bp的完整碱基序列和预测二级空间结构的基础上，我们很幸运的匹配到一段长度为52个氨基酸Sequence ID:EAW86567.1的人类待注释氨基酸序列，44.4虽然被注释为一个非编码RNA，但我们的研究结果说明不能排除它具有一定程度的蛋白质或者短肽编码能力。
~（30s）
P11:接下来向大家介绍的是本研究的核心内容，前期我们通过RNA核质分离法进行亚细胞定位检测显示44.4在肺腺癌细胞中主要位于细胞质。而经典的lncRNA胞内作用机制范例显示，包浆内的lncRNA主要通过ceRNA机制发挥作用，简单来讲，ceRNA分子可以间接增加或减少miRNA的目标mRNA的表达水平，影响细胞内的蛋白质生产。所以我们接下来的工作围绕寻找miRNA和目标mRNA展开，右侧上面这部分是我们通过生信方法找到的21个潜在的44.4下游miRNA，实验验证了其中的七个。下面这个图是7个经实验验证受44.4影响的miRNA的高置信度潜在目标mRNA集合以及蛋白质互作网络寻找潜在通路。
~（45s）
P12:承接上面的工作，我们基于高置信度目标mRNA集合进行通路的富集分析、GO分析和蛋白质互作网络结果显示44.4主要影响了细胞对生长因子（TGF）的反应，细胞运动的正向调控等，契合前期的表型实验结论。
~（25s）
P13:这一部分工作是我们针对前期7个经实验验证的潜在miRNA做了基于TCGA数据库的生存分析，结果显示，145-5p和338-3p对肺腺癌患者的生存有统计学意义的影响。在通过更多的信息检索和收集工作后，我们发现高置信度EMT相关miRNA数据库中收录的173个EMT相关非编码RNA基因列表，其中包含了前面提到的145-5p，基于此，我们把44.4潜在miRNA目标分子从七个缩小到选定为mir-145-5p。
~（35s）
P14:在生信预测145-5p的基础上，我们利用QP和双荧光素酶实验做了进一步验证，结果符合ceRNA机制的预期趋势，后者说明44.4可以直接结合145-5p，在细胞内发挥作用。
~（15s）
P15:基于145-5p的潜在作用mRNA合集展开的蛋白质互作网络分析结果显示，SMAD3、ZFYVE9、TGFBR2这三个TGF-β经典信号通路中的关键分子可能是我们找的目标信使RNA分子，我们通过QP和WB实验验证了生信预测。大家可以看到，三个分子在基因和蛋白质水平都随44.4的改变发生了具有统计学差异的改变。
~（35s）
P16:承接上面的工作，我们利用WB实验进一步探索了TGF-β经典信号通路中的关键分子受44.4的影响程度。我们发现，TGF-β信号通路分子确实不同程度受到44.4影响发生了表达改变，另外，miR-145-5P与SMAD3、TGFBR2分子的直接结合能力已有研究报道，我们通过双荧光素酶实验进一步验证了miR-145-5P与ZFYVE9的直接结合作用，基于此，我们预测44.4可能通过145-5p影响了TGF-β信号通路进而改变了细胞的EMT进程。
~（45s）
P17:剩下的工作量是围绕44.4-145-5p-SMAD3、TGFBR2、ZFYVE9调控轴展开，我们采用了经典的拯救实验来试图验证上述生信预测，右侧的图是我们通过QP和WB实验对肺腺癌细胞内145-5p 进行过表达和敲低后对下游三个信使RNA基因和蛋白质层面的影响。结果符合预测。
~（25s）
P18:这一部分内容是我们设计了在过表达44.4的细胞内引入145-5p的模拟物和44.4敲低的细胞内同步敲低145-5p的拯救策略试图探索调控轴的直接调控关系，结果符合预期。
~（15s）
P19:承接上面的工作，我们利用基于拯救策略的细胞模型进行transwell实验验证，结果显示，围绕我们发现的调控轴，细胞确实发生了我们预期的转移和侵袭特性改变。
~（15s）
P20:最后，是我小论文中希望展示给审稿人的概括课题研究框架的一个机制图，我希望通过图表的形式向大家展示44.4这个基因在肺腺癌中发挥了什么作用，以及它是怎么发挥作用的。
~（15s）
P21:最后的最后，感谢为本课题付出时间精力，帮助我走到今天的老师和朋友。我的演讲完毕，谢谢大家。
~（5s）
每个人需要准备一份个人简介发给各自导师，个人简介应包括：研究生的一般情况，政治思想表现，在学期间学位课程、英语水平、学术成果、教学及临床实践、科研进展及水平和论文评阅情况等，并说明该生是否符合答辩要求。
评论区