NEW-PROJECT 体内动物实验

课题框架：裸鼠尾静脉注射体内转移实验

工作小结

Day 1 from Johnny 进度： [>-------------------] 1/45 (2.22%)

• 进行了细胞传代培养的初步工作，高压器具，复苏四组细胞对照nc-H157、sh44.4—H157组、对照vector-A549、44.4 OE-A549组 尝试传代

• 对细胞注射浓度和培养细胞数进行了进一步研究，参考了秦的硕士论文和近期涉及相同实验的博士论文

• 沟通王维落实采购10cm皿和其他实验用品

• 小组c207开会沟通分工和项目操作细节，提出问题

Day 2 from Johnny 进度： [>-------------------] 2/45 (4.44%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 细胞观察反馈：复苏的四支细胞两支状态差，需要重新复苏，两支A549传代，重新复苏两支sh+一支nc

• 细胞合计九盘

Day 3 from Johnny 进度： [>-------------------] 3/45 (6.66%)

• 四组6cm皿细胞处理，其中昨天三支新复苏的换液，A549冻存两支，传代两支

• 采购1640培养液两瓶，沟通正合，沟通王维

• 来自王海龙的建议：两个细胞的对照都得做，因为要拍照肺结节

Day 4 from Johnny 进度： [>>------------------] 4/45 (8.88%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 落实10cm皿采购，20个，明天送，附赠一支山羊抗兔二抗

• 四瓶1640培养液今天送达，签收？

• 传代后细胞合计九盘

Day 5 from Johnny 进度： [>>------------------] 5/45 (11.1%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 四组细胞已成功复苏，可正常传代扩种

• 需新配培养基，1640延迟送货

• 明早处理细胞

Day 6 from Johnny 进度： [>>------------------] 6/45 (13.2%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 新配培养基，sh_157生长速度慢，A549 一传三，NC_157一传二，长满后保种冻存

• 1640化冰之后明天新配完整培养基

• 明早处理细胞

Day 7 from Johnny 进度： [>>>-----------------] 7/45 (14.4%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 三组H157-sh分拆成七组，其中一号待弃

• nc四盘明天待处理

Day 8 from Johnny 进度： [>>>-----------------] 8/45 (17.2%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 6cm皿够不够,不够需要去借来用

• nc两支冻存，合计细胞14盘

Day 9 from Johnny 进度： [>>>>-------------] 9/45 (19.4%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 6cm皿长满之后尝试传10cm皿，培养基用量？10ml，预期细胞量：13.7×106？

• 合计细胞皿数量14个（包含两个10cm皿测试）

• 10cm皿细胞计数

• 需要普通鼠3-5只练习尾静脉穿刺和10cm皿细胞注射预演并观察小鼠状态

Day 10 from Johnny 进度： [>>>>-------------] 10/45 (22.2%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 高压瓶子之后配200ml的完整培养基

• 练手小鼠沟通落实，博学楼c57🐭五只练习尾静脉注射和细胞浓度测试，操作地点，练习工具待落实，两只黑鼠两只白鼠，四只老鼠练手

• 要带什么东西过去博学楼：酒精、棉球+烧杯、注射工具、注射、适量PBS

• 团队内部沟通，进度和任务线更新，晚上小会取消

• 10cm皿细胞消化+细胞计数，然后拿到博学进行尾静脉注射练习，敲定浓度，沟通队友先进行三只鼠的尾静脉注射，两小时？下午三点

• 10cm皿细胞计数，下午一点半

• 需要普通鼠3-5只练习尾静脉穿刺和10cm皿细胞注射预演并观察小鼠状态，组会沟通王海龙

• 尾静脉注射固定装置借好-联系陈伟豪

Day 11 from Johnny 进度： [>>>>-------------] 11/45 (24.4%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 把两个10cm皿做细胞计数，血球计数板，四个大格子取平均数之后10^4=1ml中的细胞量，预先稀释倍数需要累加，需要510^6/ml的细胞液，然后每只注射200ul，预计细胞量是100万

• 老鼠获取

• 尾静脉注射装置+PBS适量+手套🧤+酒精棉球放烧杯+注射针💉

• 显微镜🔬不可用，晚上处理10cm皿，和700ul传代，明天下午测试细胞注射

• 明天除了细胞+冰块，需要更多PBS，棉签够不够用？

• 联系更多小鼠练手？

Day 12 from Johnny 进度： [>>>>-------------] 12/45 (26.6%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 重新细胞计数？

• 把两个10cm皿做细胞计数，血球计数板，四个大格子取平均数之后10^4=1ml中的细胞量，预先稀释倍数需要累加，需要510^6/ml的细胞液，然后每只注射200ul，预计细胞量是100万

• 小鼠细胞注射预实验

• 沟通落实小鼠采买

Day 13 from Johnny 进度： [>>>>-------------] 13/45 (28.8%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 注射小鼠观察🔎-改到明天早上

Day 14 from Johnny 进度： [>>>>>------------] 14/45 (31.0%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 注射小鼠观察🔎-状态无异常，小鼠转给小易

• 下周三裸鼠到，周六日打细胞，到时候再找两只小鼠练手？

Day 15 from Johnny 进度： [>>>>>------------] 15/45 (33.2%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 下周三裸鼠到，大概周六日打细胞

• 来自王海龙的提醒，笼子清洗、垫料高压、明辨106联系王雪薇

• 明天（周日），小组开会，沟通裸鼠饲养准备事宜

Day 16 from Johnny 进度： [>>>>>------------] 16/45 (35.4%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 下周三裸鼠到，需要做准备

• 组内小会，沟通裸鼠饲养事宜

• 细胞每个组需要3个10cm皿，400万*3=1200万，满足六只小鼠的注射量，周二每组分三个6cm皿，长满后（周四？）转到10cm皿，周六长满之后消化计数，借尾静脉注射工具后操作💉

Day 17 from Johnny 进度： [>>>>>>----------] 17/45 (37.6%)

• 四组6cm皿细胞处理

• 周三裸鼠到，需要做准备

• 四个鼠笼清洗，垫料高压

Day 18 from Johnny 进度： [>>>>>>----------] 18/45 (39.8%)

• 四组6cm皿细胞处理，十四盘6cm皿，4+4+3+3，预计周四传10cm皿，周六尾静脉注射

• 收到裸鼠24只，嘉欣和炬烩妥当安置，垫料+饮水+饲料

• 双蒸水高压

• 明天早上观察小鼠状况

Day 19 from Johnny 进度： [>>>>>>----------] 19/45 (42.0%)

• 四组6cm皿细胞处理，十四盘6cm皿，4+4+3+3，预计周四传10cm皿，周六尾静脉注射

• 饲养裸鼠24只，炬桧反馈小鼠状态，垫料+饮水+饲料

• 双蒸水高压-to:焦婉君

• 明天早上观察小鼠状况

Day 20 from Johnny 进度： [>>>>>>----------] 20/45 (44.2%)

• 四组6cm皿细胞处理，十四盘6cm皿，4+4+3+3，定量传10cm皿，预计周六尾静脉注射

• 饲养裸鼠24只，嘉欣反馈小鼠状态，垫料+饮水+饲料

• 明天早上观察小鼠状态

Day 21 from Johnny 进度： [>>>>>>>--------] 21/45 (46.4%)

• 四组10cm皿细胞处理，十四盘，4+4+3+3，状态可，预计明天下午可达消化标准，下午六点-十点操作尾静脉注射

• 双蒸水高压，垫料更换

• 预计明天下午三点操作细胞消化和细胞计数，五点左右开始操作尾静脉注射（酒精、棉球+烧杯、注射工具、注射、适量PBS？）

• 明天借注射装置，练手（博学二楼雄鼠）+操作注射，操作地点？需要准备什么？时间？（队友沟通❓）注射后鼠笼标记需要带mark笔

• 注射完毕后，实验进入第二阶段（30天的维持饲养），饲养裸鼠24只，注射后定期（每三天）记录小鼠生理数据（体重？），反馈小鼠状态，垫料更换+饮水+饲料

Day 22 from Johnny 进度： [>>>>>>>--------] 22/45 (48.6%)

• 四组10cm皿细胞处理，十四盘，4+4+3+3，消化后细胞计数，下午一点-六点操作尾静脉注注射

• 借注射装置（找310常兴悦），练手（博学二楼雄鼠2只）+操作注射，操作地点：505 需要准备什么：注射后鼠笼标记需要带mark笔，酒精、棉球+烧杯、注射工具、注射、适量PBS

• 24只裸鼠操作尾静脉注射，过程顺利，注射后观察两小时，损耗暂为0

• 明天早上七点到505观察小鼠状况

• 实验进入第二阶段（30天的维持饲养），饲养裸鼠24只，注射后定期（每三天）记录小鼠生理数据（体重？），反馈小鼠状态，垫料更换+饮水+饲料

Day 23 from Johnny 进度： [>>>>>>>--------] 23/45 (50.8%)

• 嘉欣反馈小鼠情况良好

• 明天观察小鼠状态：饮水+垫料+饲料

• 四组细胞处理

Day 24 from Johnny 进度： [>>>>>>>--------] 24/45 (53.0%)

• 嘉欣和炬烩反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

• 便签加固落实

• 小鼠尾巴上的标记用黑笔重新画

Day 25 from Johnny 进度： [>>>>>>>>-------] 25/45 (55.2%)

• 炬烩反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

• 明天下午两点小鼠称重及记录

Day 26 from Johnny 进度： [>>>>>>>>-------] 26/45 (57.4%)

• 嘉欣和炬桧反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

• 下午两点小鼠称重及记录

• 尾标脱色+1，身体做标记📌，备选方案：剪指甲

• 体重检测调整为一周一次

• 五一假期工作调整

Day 27 from Johnny 进度： [>>>>>>>>-------] 27/45 (59.6%)

• 嘉欣和炬桧反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

• 重新剪指甲做标记

Day 28 from Johnny 进度： [>>>>>>>>-------] 28/45 (61.8%)

• 小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

Day 29 from Johnny 进度： [>>>>>>>>-------] 29/45 (64.0%)

• 嘉欣反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

Day 30 from Johnny 进度： [>>>>>>>>-------] 30/45 (66.2%)

• 嘉欣和炬桧反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

• 体重更新

• 明天接手小鼠饲养至五月七号

Day 31 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>-----] 31/45 (68.4%)

• 查看小鼠情况未见异常，垫料+饮水+饲料

• 沟通王绵婧高压双蒸水备用

Day 32 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>-----] 32/45 (70.6%)

• 王绵婧反馈小鼠情况良好，垫料+饮水+饲料

Day 33 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>-----] 33/45 (72.8%)

• 小鼠目测情况良好，两个鼠笼添了饮用水

• 明天早上到五楼看小鼠

Day 34 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>----] 34/45 (75.0%)

• 小鼠目测情况良好，两个鼠笼添了饮用水

• 明天继续到五楼看小鼠

Day 35 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>----] 35/45 (77.2%)

• 小鼠目测无异常，四个鼠笼添饮用水+更换垫料

• 明天继续到五楼看小鼠+添饲料

Day 36 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>---] 36/45(79.4%)

• 小鼠目测无异常，两个鼠笼添加饲料

• 明天继续到五楼看小鼠

Day 37 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>---] 37/45(81.6%)

• 王绵婧反馈小鼠无异常

Day 38 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>---] 38/45(83.8%)

• 小鼠目测无异常，一个鼠笼添饮用水

• 明天继续到五楼看小鼠+添加饲料+饮用水

• 小鼠笼子标记📌日期4-16，理论上一个月饲养周期的话是截至5-16？

Day 39 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>---] 39/45(86.0%)

• 王绵婧反馈小鼠无异常

• 嘉欣反馈返校，做具体交接

• 小鼠笼子标记📌日期4-16，理论上一个月饲养周期的话是截至5-16？

Day 40 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>---] 40/45(88.2%)

• 嘉欣反馈小鼠无异常

• 小鼠更换了垫料+水+饲料

• 明天称重+剪指甲

• 高压双蒸水

• 小鼠笼子标记📌日期4-16，理论上一个月饲养周期的话是截至5-16

Day 41 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>>--] 41/45(90.4%)

• 嘉欣和炬桧反馈小鼠无异常

• 小鼠更换了垫料+水+饲料

• 称重+剪指甲

• 小鼠笼子标记📌日期4-16，理论上一个月饲养周期的话是截至5-16

• Weight Recording

Day 42 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>>--] 42/45(92.6%)

• 嘉欣反馈小鼠无异常

Day 43 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>>--] 43/45(94.8%)

• 嘉欣反馈小鼠无异常

Day 44 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>>--] 44/45(97.0%)

• 嘉欣反馈小鼠无异常

• 5-16日更新工作流，数据收集和分析：脱颈处死裸鼠，取出肺组织。用福尔马林固定肺组织24h，石蜡包埋切片后， 对组织进行 H&E 染色并观察。🫁解剖后统计结节数量和出血点；

• 沟通和敲定小鼠取材日期和具体时间

• 准备文案，拉老板开会

Day 45 from Johnny 进度： [>>>>>>>>>>>>>] 45/45(100.0%)

• 炬桧反馈小鼠无异常

• 双蒸水高压

1. 实验动物

21只雌性BALB/c裸鼠（4周龄），一箱SPF裸鼠饲料，一袋灭菌垫料均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养环境：SPF，23℃，相对湿度60%，12h光暗循环，食物和水充足。动物实验都经山西医科大学动物伦理委员会批准。~养殖环境需协调五楼。

2. 项目目标

• 通过体内实验理解lncRNA-AL022344.4基因在肺腺癌中的作用

• 构建肺部成瘤模型以评估目的基因实际体内效应

3. 实验设计

• 三组细胞对照组、sh44.4组、44.4 OE组，10cm皿培养

• 取处于对数生长期的稳转细胞，吸弃旧培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，胰酶消化后收集细胞至离心管中，1000rpm ， 离心5min， 弃上清。

• 用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀1 次，1000rpm ， 离心 5min， 弃上清。

• 用预冷的PBS缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为5×l0^6个/ml ， 置于冰上备用。

• 将雌性裸鼠 (4周大) 随机分为3组， 每组7只。 经尾静脉注射100ul肺腺癌细胞悬液，构建裸鼠 体内转移模型。

• 将~~小鼠随机分组。将细胞（4×10^6 个细胞/只）注射到小鼠尾静脉，~~每天观察小鼠的情况。4周后，用戊巴比妥钠麻醉小鼠（75毫克/千克体重，腹腔内注射）？？

• 8 周后脱颈处死裸鼠，取出肺组织。用福尔马林固定肺组织24h，石蜡包埋切片后， 对组织进行 H&E 染色并观察。

4. 数据收集和分析

• 收集肺部成瘤模型的生理数据：每日体重等？

• 🫁解剖后统计结节数量和出血点

• 组织进行固定、包埋、切片后进行后续的实验（HE和IHC）

5. 伦理和安全措施

所有实验均应在严格的伦理和安全指导下进行。应采取一切必要措施，以确保动物的福利，包括实验前的准备，实验期间的监控，以及实验后的处理。（肿瘤大小和麻醉药物选择）

6. 预期成果

HE+IHC+体重改变统计+成瘤数统计（肿瘤负荷）

7. 时间表

阶段一：细胞传代培养，总数？（4×106 个细胞/只）注射到小鼠尾静脉，注射液细胞浓度？（时间节点1）~两周左右

阶段二：采购裸鼠，准备饲养(时间节点2) ~提前三天

阶段三：尾静脉注射后继续饲养四周（时间节点3）~四周

阶段四：四周后取材收集数据以及后续分析

产生问题：

• 团队构建（分工和沟通课题细节）

• 搞清楚注射浓度和培养细胞数——秦的大论文~来自王海龙

• 采购10cm皿，数目？每组的小鼠数量？预留数量？一盘两只鼠？细胞稀释用什么？生理盐水

• 细胞复苏，以及如何从6cm扩到10cm皿

• 裸鼠采购，到货月龄等？

• 实验用品采购工作（注射器💉、尾巴固定器、小鼠喂养饲料等？）

来自王海龙：三个组，3x7=21只老鼠，对照组共用

1、普通鼠练习尾静脉注射

2、裸鼠喂养练习（饲养、监控小鼠生理数据）

3、造模完成后收集数据（处死后取肺组织以及后续的固定，送样等）

4、时间上协调好，希望大家付出的时间和精力不仅是对我，对大家都是有意义的

待办：现在有24只裸鼠待处理，5-18号周六饲养周期满一月。

实验内容：进入循环系统的癌细胞理论上会待在特定的器官或组织中定制，开始生长和形成新的肿瘤灶，模拟癌症的远处转移过程。

进入阶段四：造模完成后收集数据（处死后取肺组织以及后续的固定，送样等），通过组织学检查和分子生物学技术，评估癌细胞的转移特性和转移后的肿瘤生长情况。

具体怎么做：肿瘤负荷？体重记录和绘图？肺结节统计和拍照（肿瘤转移灶数量）？组织送样制片后IHC+HE(取出小鼠肺脏后，立即用福尔马林固定，送样进行石蜡包埋，切片，染色)?

来自徐白雪大论文：

为什么要麻醉小鼠？伦理需要？！

肿瘤负荷？

动物实验——收尾工作

待办：现在有24只裸鼠待处理，5-18号周六饲养周期满一月。

实验内容：进入循环系统的癌细胞理论上会待在特定的器官或组织中定制，开始生长和形成新的肿瘤灶，模拟癌症的远处转移过程。

进入阶段四：造模完成后收集数据（处死后取肺组织以及后续的固定，送样等），通过组织学检查和分子生物学技术，评估癌细胞的转移特性和转移后的肿瘤生长情况。

具体怎么做：肿瘤负荷？体重记录和绘图？肺结节统计和拍照（肿瘤转移灶数量）？组织送样制片后IHC+HE(取出小鼠肺脏后，立即用福尔马林固定，送样进行石蜡包埋，切片，染色)?

为什么要麻醉小鼠？伦理需要？！

5-18：上午九点

操作地点：小车把四框小鼠拉去博学二楼动物房

准备什么：小鼠解剖固定用的胶板，解剖剪✂️，细线固定肺组织（具体怎么弄？），1.5ml EP管+1ml福尔马林（24个事先标记好📌），生理盐水冲洗用，玻璃皿装生理盐水，肺组织解剖后拍照（手机拍？统计肺结节数量和出血点？）组织固定(福尔马林24H)，包埋，切片（HE+IHC），准备标尺

操作内容：

小鼠脱颈处死，取出肺组织。用福尔马林固定肺组织24h，石蜡包埋切片后， 对组织进行 H&E 染色并观察。

预期成果：

• 整理肺部成瘤模型的生理数据：每周体重

• 🫁解剖后统计结节数量和出血点，每个小鼠完整肺拍照

• 组织进行固定、包埋、切片后进行后续的实验（HE和IHC）

• 肿瘤负荷？

• 是否需要留提蛋白质和RNA的肺组织（锡纸和冰盒备用，组织一半一半，每只小鼠一片锡纸，不需要太大。装好组织后叠好标记清楚放到冰盒里。回来放-80℃）

micro-CT结果：

1. 图像获取和预处理

• 获取高质量的micro-CT扫描图像：确保使用高分辨率的扫描参数，通常分辨率在10-50微米之间。

• 图像重建：使用适当的算法进行图像重建，减少伪影和噪声。

• 图像配准：将多次扫描结果对齐，以便进行时间序列分析。

2. 早期肺腺癌病灶的影像学特征

• 结节形态：早期病灶通常表现为小的、边缘模糊或不规则的结节。

• 密度变化：与正常肺组织相比，癌变区域可能显示出较高的X射线吸收率，表现为高密度区域。

• 结节大小：早期病灶通常较小，一般直径在几毫米以内。

• 边缘特征：早期病灶的边缘可能会表现为毛刺状或不规则的形态，这些是恶性病变的典型特征。

3. 图像分析技术

• 阈值分割：根据灰度值分割出可能的病灶区域。

• 三维重建：利用三维重建技术，更好地观察病灶的形态和空间位置。

• 纹理分析：通过分析灰度共生矩阵（GLCM）、纹理特征（如对比度、均匀性、熵等），识别癌变区域的特征。

• 对比剂增强：在必要时使用对比剂增强图像，帮助区分癌变组织与正常组织。

4. 鉴别诊断

• 比较正常对照组：与健康小鼠的肺部CT图像进行比较，以鉴别正常解剖结构与病变区域。

• 时间序列分析：通过多次扫描观察结节的生长和变化情况，早期癌变病灶可能会显示出相对较快的生长速率。

5. 病理验证

• 组织学验证：在影像学诊断后，通过活检或解剖学病理分析，进一步确认影像学发现。

• 分子标记：使用特定的分子标记（如抗体染色）来标识癌细胞，从而在显微镜下确认早期病变的存在。

实践中的注意事项

• 定期扫描：对实验小鼠进行定期扫描，早期发现潜在的病变。

• 多模态影像结合：结合其他影像学技术（如PET、MRI），提高早期诊断的准确性。

• 数据标准化：确保扫描参数和图像处理的一致性，以便于数据比较和分析。

通过以上步骤和方法，能够较为准确地识别小鼠肺部micro-CT结果中的早期肺腺癌病灶特征。这不仅有助于基础研究，也为后续的治疗评估和新药开发提供重要支持。