大家好，我是倪林峰，就读的是医学信息专业，导师是管理学院孙焱孙教授，从研二开始我有幸来到基础病原生物学王海龙教授的团队得以进一步学习实验方法和思路设计。今天我要汇报的主要有俩点内容，一是我在这一个多学期里的研究进展，第二个，是我接下来准备怎么做。
进入正题，首先要介绍一下我的研究背景，从猴子变人开始讲起，我准备研究的这个目的基因最初是实验室老师王维王老师建议我了解和学习的，我们团队对这个基因感兴趣的原因是：它是前期实验室挖掘的高表达基因列表中的其中之一，而同期的另外一些基因已经有师姐通过实验验证过确实对肺癌有影响，所以我们认为这个基因也具有研究潜力。各嚒我拿到这个基因之后，第一时间用google scholar和pubmed查询了已有的研究成果，我了解到：我们所做的lncRNA基因因为其差异表达与恶性肿瘤存在密切关系，成为了近十年肿瘤领域的热点。lncRNA不仅在很多癌组织中表达量高于癌旁组织，后续的研究还发现其可能存在成系统的机制，在调控nsclc恶性生物学行为方面也有参与。其次，正如我同门尤玉洁在汇报中数据整理反映的，肺癌由于其高发病率、死亡率，与其相关的早期诊断和治疗一直也是热门的研究领域。具体到课题和目的基因本身，我们其实也是希望聚焦于肺癌中lncRNA的研究，以期能找到癌症诊断及预后判断的标志物。结合我自身生信专业背景，我首先对目的基因做了一定的资料收集工作，然后考虑到汇报的连贯性，我后面会把研究的目的基因简称为44.4基因
研究背景
#3 首先，查询基因数据得知目的基因AL022344.4 其实是基因LINC01518 10个转录本中的其中一个
这张图片是GTEx数据库通过 单细胞核转录实验 得到的数据：我们可以看到基因LINC01518在肺组织细胞核内的表达水平显著高于其它组织
#4 对linc01518进一步了解发现，图1所示的涉及细胞信号通路的多组学数据库中有数据支持其在1299肺腺癌细胞系中表达具有明显差异，提示该基因在肺癌中具有研究价值
figure 2 图二是TCGA数据库芯片数据中linc01518的表达情况提取
figure 3 图三是我利用q-pcr实验验证实际目的基因在我们现有细胞系中的表达情况，上面这张图是前期实验室的一个根据现有实验室肺癌细胞系做的一个预筛，我们可以看到157细胞表达情况相对最高，但是细胞培养情况不理想，下面这张图片是我们引入生信分析后，在对数据库数据和现有培养成功细胞系做匹配之后重新做的pcr验证，我们看到1703相较对照组正常的肺上皮细胞具有明显的统计学差异。
figure 4 图四从CCLE数据库获得的1403个细胞系中linc01518表达情况同我们实验室现有培养的细胞系交叉对比后得出的预测结果，可以看到，在我们现有液氮冷冻保种或者正在传代培养的细胞系中，1299、1703的基因表达量相对更高，我们做这一步工作，是试图找到最适合的细胞系，进行细胞培养，然后利用质粒转染进行敲低和高表达，来验证我们从现有文献当中查到的目的基因对肿瘤细胞生物学行为的趋势影响。
figure5 图五是我们前期尝试通过慢病毒感染构建目的基因敲低模型，结果比较理想
#既然确定其相关基因在肺癌细胞中的表达具有差异性，我接下来的工作就是对目的基因展开了进一步的资料收集，在这个图中大家可以看到两个RNA二级结构和一些数字
#5 研究对象介绍：首先我们选取的研究对象由519个碱基构成，你们可以看到左侧是两个国外科研机构利用机器学习技术以最小自由能原则预测和模拟出的该基因的二级结构图。左图蓝色的小点点是根据碱基互补配对原则预测的可能与其发生作用的23个 miRNA 家族存在相互作用的具体位点，这部分工作一个是为下一步NCBI引物设计做铺垫，其二是希望通过碱基对互补原则对可能结合区域做预测。以期能帮助我们找到与其发生作用的miRNA或着蛋白质。另外，通过数据库芯片数据的统计分析，我们了解到在正常样本中，其表达与4990个基因显著正相关。它参与精子发生等生物学过程，具有分子功能。而在癌症样本中，其表达与28个基因显著正相关。
了解了lncRNA的基因信息之后，为探索其可能的作用机制，我又对目的基因的亚细胞定位信息做了查找和汇总，为什么要做亚细胞定位的判断呢，根据前期高引用量lncRNA综述文章所指出，细胞核中的LncRNA一般通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达，也能通过参与组蛋白修饰或募集转录因子而参与基因的表达调控；而在细胞质中的LncRNA则主要作为一种竞争性内源性RNA与miRNA相互作用，参与靶基因的表达调控。通俗的讲就是：lncRNA的位置很大程度上会决定它发挥怎样的功能，如果是定位在细胞质，那它可以结合miRNA或者mRNA发挥作用，调控蛋白质的翻译降解，如果定位在细胞核，大多与基因的转移，染色质的修饰，DNA的甲基化等有关
#6 通过数据库lncRNA信息的搜集分析，我发现，虽然目的基因在细胞核、细胞质、外泌体中都有表达，但在细胞质中的表达量要高于其他亚细胞位置。有一点遗憾的是，现有的目的基因亚细胞定位数据库数据基于深度学习预测，后续我们会通过FISH实验或者核质分离法实验重新审视目的基因在选取细胞系内的亚细胞定位情况。在此基础上，我们根据现有数据库资料谨慎推测目的基因主要存在于细胞质中并且很可能是通过ceRNA机制参与了靶基因的表达调控。
#7 接下来这张图希望向大家展示的是lncRNA在细胞内的作用机制主流认识，图左侧部分是细胞质，右边是细胞核，左侧的细胞质内，我们可以看到A和B两类，lncRNA可以通过RNA-RNA结合的方式发挥作用，也能通过RNA-蛋白质结合的方式发生作用，右侧的细胞核lncRNA则有 C类指导原型：指导核糖核蛋白复合物定位到特定目标，D类诱饵原型：与其他调控RNA或蛋白结合并隔离，E类支架原型：作为相关分子元件（蛋白和/或RNA）组装的平台发挥作用，说到这儿，插一嘴，在与课题组导师做进一部的沟通探讨之后，我决定把注意力放在A类RNA-RNA相互作用的miRNA sponge这一点和RBP(也就是RNA结合蛋白)两个方向进行研究。RBP是现在细胞核内lncRNA研究的热点方向之一，我的导师王维王老师也曾向我强调，实验存在很多未知及不确定性，要做预判和留备选方案，我深以为然，后面实验验证过程如果支持目的基因在细胞核内表达更高的，那我会优先考虑通过这个机制做进一步研究。而miRNA sponge这个机制是我今天想重点谈到的，sponge这个单词不常见，动画片海绵宝宝的英文名就是SpongeBob，它是海绵的意思。在上一张ppt中我有提到，现有的三个数据库资料都显示我们的研究基因在细胞质内发挥作用的可能性要比在细胞核内要大的多，在实验验证以前，我谨慎推测目的基因主要存在于细胞质中并且很可能是通过ceRNA机制参与了靶基因的表达调控。
那么什么是ceRNA机制呢？
lncRNA因其存在Introns等片段，长度可达数千nt（核苷酸），这就为吸附结合大量的miRNA提供了良好的物质基础，通过竞争占有胞内大量的miRNA，像海绵一样缓冲并削减其干涉靶基因mRNA编码蛋白的能力，我们就称这样的lncRNA与mRNA互为ceRNA关系，因此可见，作为关联节点的就是miRNA，它的靶构成了ceRNA，共同组合就是ceRNA网络。ceRNA可以看做是一种平衡，当平衡被打破时，则会导致生命活动的紊乱，出现各种非正常形状，引起疾病的发生等，尤其是在肿瘤等复杂疾病研究领域尤为重要。在过去十年内，ceRNA机制成为了RNA研究领域的热门方向，众多研究中，对抑癌基因PTEN相关ceRNA调控机制的认识较为成熟。
#8 基于以上的生信分析基础，包括但不限于已有的科研成果思路借鉴，数据库体现的基因表达情况，亚细胞定位的预测，以及对该基因的现有了解让我们课题组考虑通过ceRNA这一机制对目的基因进行更深层次的研究。
接下来，简单的讲一下目的基因的研究现状
研究现状
#10 这里向大家展示的是我查询到的课题相关现有研究成果中的一小部分内容，通过文献查询和汇总，我了解到如下3点内容：
1、我们可以通过图情分析的方法看到lncRNA这一研究领域在过去一段不短的时间内都受到了很多研究者青睐。
2、已有研究者针对lncRNA在肺癌领域的作用作出探索以及积累了一定的成果，其研究结果为肺癌的治疗和早期诊断提供了新的见解和方向。
3、针对目的基因的研究工作相对缺乏，且截止演讲稿编辑日期，在肺癌领域没有查到已发表的科研成果。
通过对前人研究成果的学习和理解，我认识到自己想要解决的具体学术问题以及希望有所突破的地方就是：通过对目的基因在nsclc中的作用机制的具体探索，以期能找到其在早期诊断和治疗中是否具有作为靶点的潜力。研究的起点是实验室对lncRNA多年研究积攒的课题经验和实验验证的实践操作，预期的创新点是希望结合自己的医信专业背景在实验设计的同时辅以数据库挖掘工作对研究对象和研究进程进行交叉验证。
以上这些是我想向诸位展示的课题具有的理论和实践意义。也是我研究的出发点。接下来，我想跟大家聊聊自己研究的思路，这次汇报的第二块内容，也就是我准备怎么做这个课题。
#12首先是我的研究目标，首先是，研究目的基因在肺癌中可能发挥的作用，其次是找到ceRNA调控通路，即找出目的基因对应的miRNA和作用的mRNA，并通过其靶向调控关系，来为发文章搭建结构基础和寻找治疗靶点的潜在依据
#13接下来是涉及到的具体的研究内容，这一块，我放了很多文字在ppt上面，简单介绍一下，首先我准备做的是，目的基因在肺癌中的恶行生物学作用研究
如ppt所列明，我希望通过实验涉及验证如下几点，1、检测目的基因差异性表达 2、搜集临床信息做分析 3、亚细胞定位情况 4、通过目的基因敲低、高表达的方式，检测目的基因对肺癌细胞功能的影响
#14其次，我要做的就是目的基因与下游miRNA之间的验证，这里涉及两个方面，一个是如何确定miRNA，另一个是用实验验证两者的相互作用关系。关于如何确定miRNA，我通过前期数据库数据收集整理，利用我们的目的基因lncRNA碱基序列查找可能发生作用的miRNA
#15结果如你们所看到的，我首先利用miRdb、mircode、encori、incbasev3四个数据库查看了目的基因可能存在互作关系的miRNA，根据四个数据库数据的汇总，我整理出了一个包含22个兴趣miRNA的列表，并且整理了每一个miRNA的序列和与目的基因结合的最小自由能。理论上，结合的最小自由能越小，他们两者结合需要的能量越低，也就是说，在理想条件下，他们越容易结合到一起，排序之后得到了这样一张表格
#16 左上角的表格中列明了22个兴趣miRNA的名称，序列，以及与目的基因结合最小自由能的具体参数。右侧的图是miRNA与目的基因结合的具体位点、结合碱基量、最小结合自由能详情概览。综合考虑之后，我最后选择hsa-miR-139-5p这个miRNA作为首选的ceRNA关联节点进行更深入的研究。原因是他在最小结合自由能排序中位列第二，且总匹配的碱基对数量要高于其他miRNA，基于此，我有理由相信它是最有可能在后期实验验证中与目的基因发生关联作用的ceRNA节点基因。
#17 在明确目的基因和miRNA并且经过实验验证两者的关联性之后，接下来我准备开展的工作是研究两者相互作用对肺癌恶性生物学作用的机制，方法预计为设立以上的五组细胞模型，并且检测各组中肿瘤细胞增值、凋亡、迁移、侵袭的能力和对应标志物分子mRNA及蛋白的表达情况，如果能看到预期的趋势，将会进一步将以上细胞进行裸鼠皮下植瘤测试，检测其对裸鼠移植瘤生长的影响。
#18是我简单做的一个技术路线图
想展现给大家的是我对这个research proposal的设计思路以及对应的工作节点和走向，附的文字是帮助我做判断的生信方法和拟采用的实验验证方法。
#19 实验方案这部分的内容，我有在这研究内容中提及，如我所列明的，主要也是围绕着目的基因的表型研究和ceRNA机制的挖掘验证展开的
#20在可行性分析这一块，因为课题有王海龙教授团队的设备支持和几位导师前期立项研讨过程，所以个人认为是有保障的。具体到课题本身，ceRNA机制本身也是作为近十年研究热点已有一系列科研结果支持其科学性的，具体到实验方法，我同课题组的师姐因为也是研究lncRNA，所以积累了丰富的实验经验，我想实验设计和验证过程也是有一定可行性啊。
#21 预期的研究成果这块，除了课题本身对目的基因的研究结果展示和ceRNA机制的验证和阐明，最重要的是希望基于此基础进一步完善整个设计框架和学习到研究方法。最后不管是期刊要求的补实验还是对其中说服力不足的点进行再验证再完善，希望能够有机会发表SCI。
~~#21可行性分析课题组前期接受过与课题中实验相关的科研训练，本课题所涉及的各项实验操作都积累了重要经验。~~
~~项目依托单位山西医科大学具有先进的实验技术支撑条件和良好的学术环境。学校医学转化中心拥有先进的生命科学实验仪器和设备，可为在分子和细胞水平上进行一系列样品制备、纯化、分析、检测和鉴定等实验提供系统的技术支持。山西医科大学实验动物中心是实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，拥有SPF级标准的实验动物饲养室。以上两个中心均可为本研究提供良好的平台，是完成研究工作的重要保证之一。~~
#23 关于研究工作基础这一部分，我希望通过自己既有的知识背景和团队给予的帮助，能够更好的完成课题。
#24 论文进度安排这一块，是给自己订立每一个步骤的时间节点（deadline），以帮助我依序推进工作进程。
#26 最后这个部分我本来是考虑去掉的，因为王海龙王教授曾友善的提醒我ppt应当做的更精练些，但我还是希望导师和在座的各位教授能够看到我预计会面临的一些问题，并且能帮助我解决可能遇到的这些问题。
#ENDING，以上是我开题汇报的所有内容，很抱歉准备的不够充分，实验思路大部分也是基于数据库预测和推断，本身对于研究机制、实验验证方案的选择也有不足，我知道做学术研究最讲究逻辑层面的严谨和思路设计层面的科学合理性，这也是我个人存在的不足，恳请各位老师批评指正！感谢大家。
生物信息学分析
采用实时荧光定量PCR**(**Q-PCR)验证的胞内表达与ceRNA机制相符的 7 个 miRNA 进行生物信息学分析，在 miRTarBase、miRDB 和 TargetScan 中鉴定出318个潜在的 miRNA 靶基因（15）。利用STRING对这些靶基因之间的相互作用网络进行可视化（15）。使用GO和KEGG对318个靶基因进行富集分析（16）。
我们发现GO BP中的前10条通路与OA的发展相关，例如对转化生长因子（TGF）-β的反应**（**图 5 ）。
我们绘制了GO路径之间的网络图**（17）**发现GO通路网络的枢纽是间充质发生、间充质细胞分化和通过伪足的延伸和收缩完成的细胞迁移以及跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路，这表明间充质细胞的改变与跨膜受体蛋白激酶信号的改变在相关通路之间存在相对重要的作用。我们还发现该网络中 MSC 相关通路与 TGF-β 相关通路之间存在密切关系，表明 MSC 可能有助于通过 TGF-β 通路调节 OA。此外，还检测到与 OA 发展相关的 KEGG 术语，包括 MAPK 和 P13K-Akt 信号通路（附加文件 2：图 S40）。网络图揭示了OA相关miRNA的功能与其靶基因之间的密切关系，而不同miRNA的靶基因也可以在相同的生物学功能中发挥各自的作用（附文件2：
多物种保守性强的lncRNA更可能发挥重要作用
可以与miRNA…等几种重要的mRNA结合
基因的表达高，在肺鳞癌细胞系中
研究内容与方法
阐述研究工作总体安排
拟采取的技术路线、研究方法、步骤和主要研究内容
论文结构框架
阐述研究工作可能遇到的困难和问题以及解决问题的方法和措施
#这里需要做个流程图#
##报告结束后要表示感谢。
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